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一、勻漿介質(zhì)的制備:
一般采用pH 7.4, 0.01mol/L Tris-HCl, 1mmol/L EDTA-2Na, 0.01mol/L蔗糖,0.8%氯化鈉溶液或直接用0.86%的生理鹽水作為勻漿介質(zhì)。
二、組織勻漿的制備
1、取組織塊(0.1g~0.2g)*少可到2~5mg在冰冷的生理鹽水中漂洗,除去血液,濾紙拭干,準(zhǔn)確稱重,放入5ml的勻漿管中。
2、按重量(g):體積(ml)=1:9的比例加入9倍體積的勻漿介質(zhì)(pH7.4, 0.01mol/L Tris-HCl,1mmol/L EDTA-2Na ,0.01mol/L蔗糖,0.8%的氯化鈉溶液)或者0.86%的生理鹽水于勻漿管中,冰水浴條件下,用眼科小剪盡快剪碎組織塊。
3、勻漿的方式有多種:手工勻漿,機器勻漿,超聲粉碎。
① 手工勻漿:左手持勻漿管將下端插入盛有冰水混合物的器皿中,右手將搗桿垂直插入套管中,上下轉(zhuǎn)動研磨數(shù)十次(6~8分鐘),充分研碎,制成10%的勻漿液。
② 機器勻漿:用組織搗碎機10000~15000 轉(zhuǎn)/分 上下研磨制成10%組織勻漿,也可用內(nèi)切式組織勻漿機制備(勻漿時間10秒/次,間隙30秒,連續(xù)3~5次,在冰水中進(jìn)行),皮膚、肌肉組織等可延長勻漿時間。
③ 超聲粉碎:用超聲粉碎機進(jìn)行粉碎,可用Soniprep150型超聲波發(fā)生器以振幅14微米超聲處理30秒使細(xì)胞破碎,也可用國產(chǎn)超聲波發(fā)生儀,用400安培,5秒/次,間隙10秒反復(fù)3~5次。
鏡檢觀察:取少量組織勻漿作涂片(直接涂片、染色均可以),顯微鏡下觀察細(xì)胞是否破碎,若沒有則可延長勻漿時間。
4、將制備好的10%勻漿液用普通離心機或低溫低速離心機2500轉(zhuǎn)/分左右,離心10~15分鐘,取上清液進(jìn)行測定.
三、樣本保存:
動物組織樣本暫時不測定,可立即低溫凍存,溫度越低越好,中間如*凍融,-20℃以下可保存三個月,-70℃以下可保存六個月。