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ELISA測定的常用模式--固相捕獲法測IgM抗體
發(fā)布時(shí)間： 2010-01-25 點(diǎn)擊次數(shù)： 2289次在病原體急性感染的診斷中，通常需檢測IgM抗體，如急性甲型肝炎診斷的血清抗HAVIgM檢測、急性乙型肝炎病毒感染的血清抗HBc lgM檢測和TORCH項(xiàng)目的系列IgM檢測等。IgM抗體也有使用間接法測定的，如目前在市場上可見到的有些TORCH系列的IgM檢測試劑盒。在使用間接法測IgM抗體時(shí)，由于臨床血清樣本中含有高濃度的IgG抗體，其中部分特異IgG抗體將與IgM抗體競爭與固相抗原結(jié)合，從而干擾IgM抗體的檢測。
因此，在使用間接法測定IgM抗體時(shí)，通常須將血清樣本用抗人IgG抗體或SPA預(yù)處理，以去除IgG的干擾。這樣不但測定較為繁瑣，而且影響測定的特異性和靈敏度。目前，常用的IgM抗體檢測方法為捕獲法，即以抗人IgM抗體（抗人u鏈）作為固相抗體，當(dāng)加入血清標(biāo)本時(shí)，其中的IgM類抗體（特異的和非特異的）即可被固相抗體捕獲，再加入特異抗原，其與固相上捕獲的IgM抗體結(jié)合后，加入酶標(biāo)抗特異抗原的抗體，zui后加入底物顯色。具體操作步驟如下：1．首先將抗人IgMbt鏈抗體于碳酸鹽緩沖液中40c下過夜包被聚苯乙烯等固相，形成固相抗體，洗滌去除未與固相結(jié)合或結(jié)合不緊的抗體后，用小牛血清或牛血清白蛋白等封閉，洗滌去除未結(jié)合的部分及雜質(zhì)。2．加入含待測IgM抗體的臨床樣本如血清等，溫育一定時(shí)間后洗板；此時(shí)，待測樣本中的IgM抗體就會與固相上的抗P鏈抗體反應(yīng)而吸附于固相上。3．加入特異的抗原如HAV抗原、HBcAg等，溫育一定時(shí)間后洗板；此時(shí)，特異抗原就會與固相上的特異IgM抗體發(fā)生反應(yīng)。4．加入酶標(biāo)記的抗特異抗原的抗體，溫育一定時(shí)間后洗板；此時(shí)，在固相上即形成相應(yīng)的抗原抗體復(fù)合物。5．加入酶底物，溫育顯色測定（圖2—10）。
本方法要著重注意的是RF（1gM類）及其他非特異IgM的干擾。RF（1gM類）由于其能與固相抗人u鏈抗體結(jié)合，并可與隨后加入的酶標(biāo)抗體（動物IgG）反應(yīng)，從而導(dǎo)致假陽性反應(yīng)。而非特異IgM由于其在*步溫育中，可與特異IgM競爭與固相抗體結(jié)合，所以會影響測定的靈敏度。因此，使用本法測IgM，必須對臨床樣本進(jìn)行適當(dāng)稀釋。樣本稀釋后，上述產(chǎn)生干擾作用的非特異IgM含量減少，而特異IgM由于處于相應(yīng)病原體的急性感染期，滴度很高，一定稀釋后，不會有明顯影響，況且，在某些病原體如HBV的慢性感染階段，IgM類特異抗體也能持續(xù)存在，只不過滴度要低很多。因此，如不對血清樣本稀釋，就直接檢測，即使是沒有非特異IgM的干擾，陽性測定結(jié)果也沒有急性感染的診斷價(jià)值?，F(xiàn)在，有些試劑生產(chǎn)廠家，為了迎合臨床實(shí)驗(yàn)室減輕勞動強(qiáng)度、簡便操作的要求，生產(chǎn)了不需對樣本進(jìn)行稀釋的抗HAVIgM和抗HBclgMELISA試劑盒，現(xiàn)有不少實(shí)驗(yàn)室也在使用。鑒于上面提到的原因，我們建議臨床實(shí)驗(yàn)室在做抗HAVIgM和抗HBc lgM等類檢測時(shí)，應(yīng)使用對樣本進(jìn)行稀釋的試劑盒，以保證檢測的臨床價(jià)值。